沙門(mén)氏菌流行性的增加以及豬對抗生素耐藥性增加促使人們尋找抗生素的替代品。腸桿菌肽(MccJ25)是一種由大腸桿菌產(chǎn)生的抗菌肽，對包括腸道沙門(mén)氏菌在內的幾種病原菌都有很強的抑制作用。
本研究旨在體外評價(jià)腸桿菌肽對豬結腸微生物區系組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動(dòng)物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對比試驗。使用Illumina MiSeq技術(shù)對16S rRNA進(jìn)行測序以評估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來(lái)評估抗生素降解產(chǎn)物和監測豬結腸微生物區系代謝組的變化。
結果表明，腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理只引起豬結腸微生物區系微生物多樣性和代謝組的細微變化，而利福平引起氨基酸水平的顯著(zhù)改變。盡管這些發(fā)現需要在體內進(jìn)行驗證，但考慮到腸桿菌肽對病原體的選擇性和強大的抑制活性，這項研究為考慮腸桿菌肽作為獸醫和農業(yè)應用中抗生素的可能替代品提供了第一個(gè)概念證明。
腸桿菌肽對豬腸道菌群連續培養模型的影響
Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model
由于國際市場(chǎng)的不斷擴大，生豬生產(chǎn)已成為增長(cháng)最快的產(chǎn)業(yè)之一。2019年，豬肉是全球第二大消費肉類(lèi)，占肉類(lèi)總產(chǎn)量的32.6%。盡管如此，養豬業(yè)近年來(lái)遭受了重大損失，主要原因是細菌感染率不斷上升。沙門(mén)氏菌會(huì )引起急性疾病，導致死亡率增加和生產(chǎn)力下降。豬是腸道沙門(mén)氏菌的主要宿主，沙門(mén)氏菌感染與豬只的腹瀉密切相關(guān)。許多沙門(mén)氏菌血清型已被證明與豬的慢性潰瘍性結腸炎或壞死性小腸結腸炎有關(guān)。因此，在養豬場(chǎng)，特別是在工業(yè)化國家，控制沙門(mén)氏菌感染在很大程度上是通過(guò)使用抗生素實(shí)現的。
抗生素被廣泛應用于人類(lèi)和獸醫以及家畜生產(chǎn)中，以治療細菌性疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(cháng)。它們在養豬生產(chǎn)中用作生長(cháng)促進(jìn)劑是常見(jiàn)的，并對提高牲畜生產(chǎn)力和降低生產(chǎn)成本做出了重大貢獻。然而，它們的過(guò)度使用導致了多種抗藥性細菌的出現。這引起了公眾的關(guān)注，并導致幾個(gè)國家禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素作為生長(cháng)促進(jìn)劑?，F在迫切需要有效替代常規抗生素，以維持豬群健康和生產(chǎn)力。到目前為止提出的最有希望的替代品是由細菌產(chǎn)生的天然抗菌肽。
抗菌肽是由細菌產(chǎn)生的，其分子質(zhì)量通常小于10 kDa。與常用的廣譜抗生素不同，抗菌肽是從mRNA翻譯而來(lái)的，其活性譜很窄，在納摩爾濃度下抑制相同或密切相關(guān)物種的菌株?？咕目蓮V泛應用于農業(yè)食品、人類(lèi)和獸醫等領(lǐng)域。腸桿菌肽(MccJ25)是研究最多的抑制革蘭氏陰性菌的抗菌肽之一。它具有典型的套索結構，這種高度緊湊的結構使腸桿菌肽對變性條件、高溫、極端酸堿性和某些蛋白酶具有顯著(zhù)的穩定性。添加腸桿菌肽的日糧已被證明可以改善斷奶仔豬的生長(cháng)性能，減輕腹瀉和全身炎癥。伴隨著(zhù)大腸桿菌減少，乳桿菌和雙歧桿菌種類(lèi)的增加，提高了短鏈脂肪酸(SCFA)的含量。
在本研究中，我們使用PolyFermS連續發(fā)酵模型模擬豬近端結腸，在體外評價(jià)腸桿菌肽對豬結腸微生物區系組成和代謝活性的影響。將腸桿菌肽與廣譜常規抗生素利福平、羅伊氏乳桿菌進(jìn)行了比較。此外，我們通過(guò)研究這三種抗菌化合物的降解產(chǎn)物，探究它們對豬結腸微生物區系代謝的影響。
采用PolyFermS體外連續發(fā)酵模型，采用改良的Macfarlane培養基模擬豬近端結腸。在35天的發(fā)酵過(guò)程中，含有固定化豬糞便微生物群的第一階段反應器與兩個(gè)第二階段控制和測試反應器并行運行，測試腸桿菌肽對微生物群組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動(dòng)物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對比試驗。使用Illumina MiSeq技術(shù)對16S rRNA進(jìn)行測序以評估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來(lái)評估細菌素/抗生素降解產(chǎn)物和監測豬結腸微生物區系代謝組的變化。
圖1：連續發(fā)酵實(shí)驗的實(shí)驗裝置。
(A)由一個(gè)接種反應堆和兩個(gè)試驗反應堆組成的PolyFermS模型概述。IR：固定化豬糞細菌的接種反應器(30%v/v)；TR1、TR2：試驗生物反應器；S：穩定期；T：處理期；W：洗滌期。
(B)實(shí)驗處理和樣本收集時(shí)間表。
根據PMA-qPCR分析，在加入沙門(mén)氏菌和抗菌藥物后的前12小時(shí)內，試驗反應器中特定菌群數量在總體組成上保持相對穩定。然而，利福平對總細胞和擬桿菌的數量有誘導作用，直到發(fā)酵結束，除了乳酸菌科外，這些細菌群重新生長(cháng)。在發(fā)酵12小時(shí)后，單獨用沙門(mén)氏菌處理也觀(guān)察到類(lèi)似的效果，特別是對乳酸菌數量的影響。相比之下，羅伊氏乳桿菌和腸桿菌肽對細菌總數沒(méi)有顯著(zhù)影響。
通過(guò)對16S rRNA基因的測序，評估了受試抗菌劑對微生物區系組成的影響。沙門(mén)氏菌處理和羅伊氏乳桿菌處理組沒(méi)有檢測到微生物組成的顯著(zhù)變化，這表明這些處理對24小時(shí)發(fā)酵過(guò)程中測得的總體微生物區系組成沒(méi)有影響。另一方面，與沙門(mén)氏菌相比，腸桿菌肽和利福平有顯著(zhù)差異(p＝0.001)。
利用香農指數和asv聚類(lèi)，通過(guò)α多樣性研究了處理對豬腸道微生物區系的影響(圖2)。結果表明，在發(fā)酵結束前的8h，利福平處理后的α多樣性顯著(zhù)降低，證實(shí)了利福平對微生物區系組成具有影響。在結腸發(fā)酵結束時(shí)，沙門(mén)氏菌組α多樣性下降，但并不顯著(zhù)；腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理組在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有引起阿爾法多樣性的顯著(zhù)變化。
圖2：用16S rRNA基因擴增序列測序法測定沙門(mén)氏菌單獨接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)合用對豬腸微生物區系的影響。
通過(guò)門(mén)水平的分類(lèi)分析，進(jìn)一步評估了受試抗菌劑對豬腸道微生物區系組成的影響。結果表明，利福平處理導致了變形桿菌和菌門(mén)變形桿菌的相對豐度增加(圖3)。
圖3：沙門(mén)氏菌單獨接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種后，豬微生物區系基于16S rRNA基因的微生物群落結構。
此外，從8小時(shí)開(kāi)始，利福平對大腸桿菌(ASV002)的相對豐度顯著(zhù)增加(12小時(shí)的相對豐度超過(guò)44%)(圖4)。
圖4：沙門(mén)氏菌單獨接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種對豬腸微生物區系的影響。
這些數據表明，與其他測試的抗菌劑相比，利福平顯著(zhù)影響微生物區系組成，會(huì )影響腸道微生物區系的代謝活動(dòng)。
用LC-MS分析發(fā)酵液顆粒提取物，以評價(jià)腸桿菌肽、羅伊氏乳桿菌和利福平對豬結腸微生物區系代謝的影響。如圖5所示，腸桿菌肽和利福平對代謝組學(xué)的影響最大，但腸桿菌肽的作用隨著(zhù)時(shí)間的推移而降低，而利福平的作用則增加(圖5B)。處理24 h后，腸桿菌肽處理組的代謝組學(xué)特征與試驗前接近。相比之下，利福平對豬結腸微生物區系代謝組有顯著(zhù)影響，且隨時(shí)間延長(cháng)而增加。
圖5：PolyFermS模型中豬結腸微生物區系的代謝組譜。
(A)通過(guò)LC-MS獲得的每個(gè)處理的基峰色譜圖。
(B)從LC-MS數據獲得的PCA計分圖(左：PC1與PC2，右：PC1與PC3)。
由于腸桿菌肽對病原菌的選擇性、強大的抑制活性、穩定性以及它引起的微生物區系組成的細微變化，腸桿菌肽可能被認為是養豬領(lǐng)域中可能的抗生素替代品。
參考文獻：Naimi S, Zirah S, Greppi A, Lacroix C, Rebuffat S, Fliss I. Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model. Front Microbiol.
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